烟草(Nicotiana tabaccum)在中国国民经济中占有重要地位，而赤星病是严重危害烟草生产的病害之一。赤星病菌(Alternaria alternata)主要危害成熟期叶片，一旦气候条件适宜，极易造成大面积流行，致使烟草生产遭受重大损失。培育抗病品种是控制赤星病发生的最经济有效的措施。净叶黄是中国最早育成的抗赤星病品种(王素琴等, 1995, 烟草科技, (1): 30-32)，也是中国抗赤星病育种利用的主要抗源(佟道儒, 1997, 中国农业出版社, pp.432-438)，在分子水平上对其抗性进行深入细致地研究具有非常重要的意义。

Bindler等(2011)发布了烟草高密度遗传连锁图谱，其中包括2 000余对SSR引物，这为我们提供了方便有效的研究工具。蒋彩虹等(2011)参照Bindler等(2007)公开发表的烟草SSR序列合成引物，从中筛选到一个SSR标记SR1160，它与净叶黄抗赤星病基因有连锁关系。根据Bindler等(2011)的高密度遗传连锁图谱，可以确定该标记位于M号连锁群上。据此，本研究将高密度遗传连锁图谱中位于M号连锁群上的130对SSR引物进行合成及扩增筛选，获得了一个净叶黄抗赤星病基因的SSR标记连锁群。

1结果与分析
1.1引物筛选结果
根据前期的研究结果，标记SR1160位于M号连锁群上。为了筛选到与净叶黄抗赤星病基因连锁更加紧密的标记，并作出抗病基因的SSR标记遗传连锁图，将高密度遗传连锁图谱中，位于M号连锁群上的130对引物进行了合成，以感病亲本NC82和抗病亲本净叶黄的DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并银染显色，大部分引物组合都能扩增出清晰条带。经过3次重复扩增检测，筛选出在抗病和感病亲本间稳定表现多态的引物12对，多态性比率为9.23%。

1.2连锁图谱的构建
选用划伤悬滴法，以净叶黄为抗病对照，NC82为感病对照，对F₁及F₂群体各个单株人工接种鉴定抗病性。每株供试材料接种两片底部叶片，在用于接种叶片的主脉两边用接种针分别做3个十字划伤，在划伤上悬滴一滴接种菌液，保持高温高湿培养20 d后调查发病情况。病级统计共分5级：无浸染的为0级；25%的划伤有浸染但无扩展的为1级；50%的划伤有浸染且稍有扩展的为2级；80%的划伤有浸染且形成病斑的为3级；100%的划伤有浸染且形成较大病斑的为4级。

在抗性鉴定的基础上，以(净叶黄×NC82) F₂代110个单株为作图群体，将筛选出的12对多态性引物进行了扩增(图1)。

图1 某引物在部分F2分离群体中的扩增结果 注: M: DL700 marker; P1: 净叶黄; P2: NC82; F1: F1代; F2: F2代部分单株; a: 特异带 Figure 1 Polymorphism produced by one primer among the partial plants of F2 population Note: M: DL700 marker; P1: Jing-yehuang; P2: NC82; F1: F1 generation; F2: Partial F2 plant; a: Characteristic band

带型按如下方法统计并建立数据库：带型与净叶黄一致的记为0，带型与NC82一致的记为1，带型与F₁代一致的记为2。利用软件Windows QTL Cartographer对数据进行整理分析并作图。这12个多态性SSR标记全部连锁到一个连锁群上，连锁图全长181.5 cM，平均间距约15.1 cM，抗性基因位于标记J9与J4之间，与标记J9间的遗传距离最近，为4 cM，与J4间的遗传距离为23.3 cM (图2)。

图2 一个净叶黄抗赤星病基因的SSR标记连锁群 注: a: 赤星病抗病QTL Figure 2 A linkage group of SSR markers linked to the resistant gene of Jing-yehuang on Tobacco brown spot Note: a: Resistant QTL of Tobacco brown spot

2讨论
Moore等(1991)创立的SSR标记(simple sequen- ce repeats)具有很多优点，主要包括带型简单、共显性、高多态性以及覆盖整个基因组等，而且该技术使用的特异双引物是根据简单重复序列两侧的保守单拷贝序列设计而成，因此，该技术的重复性和稳定性很好。然而，与其他作物相比，SSR标记技术应用于烟草研究起步较晚。这是由于以前烟草上开发出的SSR引物很少，限制了其在烟草研究中的应用，在许多相关研究中只能选择使用非特异性引物的标记技术，如RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等，稳定性及重复性较差。Bindler等(2007)发表了烟草SSR引物标记遗传图谱，但是仅含有282对SSR引物。本研究利用这282对SSR引物序列，从中筛选出一个标记SR1160，它与净叶黄抗赤星病基因有连锁关系，遗传距离约为9.37 cM，遗传距离相对较远。

Bindler等(2011)发布了烟草高密度连锁图谱，约有2 000余对SSR引物，这就为利用此技术对烟草进行深入细致的研究提供了良好的工具。分子标记辅助选择的准确率取决于目标基因和分子标记间的遗传距离(黄晨和李思易, 2008)，目标基因和分子标记间的遗传距离愈小，选择的准确率就愈高(郑康乐和黄宁, 1997)。因此，为了筛选到与抗性基因连锁更加紧密的标记，并作出净叶黄抗性基因的遗传连锁图，将抗性基因定位，参照Bindler等(2011)发布的烟草高密度连锁图谱，查到标记SR1160位于M号连锁群上，据此将M号连锁群上130对SSR引物进行扩增筛选，获得了一个包含12个标记的连锁群，其中标记J9与抗性基因的遗传距离仅为4 cM，比标记SR1160与抗病基因的遗传距离近了很多，利用它进行辅助选择，准确率将大大提高。在该连锁群上，SR1160与抗病基因的遗传距离为14.3 cM，与前期的研究结果有较大偏差，这可能是由于两次使用的F2单株不同，而且所用的群体较小造成的，因而在将来的进一步相关研究中，最好扩大群体或采用永久群体以减小误差。在本研究中，还将抗性基因定位在标记J9与J4之间，根据两端的标记进行选择，将有效提高选择效率，也为下一步抗性基因的精细定位奠定了良好的基础。

3材料和方法
3.1材料
抗烟草赤星病品种净叶黄与感病品种NC82，由中国农科院烟草研究所遗传育种中心提供，用它们作为亲本配制杂交组合(净叶黄×NC82) F₁，F₁代自交获得F₂代分离群体。将上述材料种植于温室内，按常规方法管理。

3.2接种方法与赤星病菌液制备
采用划伤悬滴法接种。菌种由中国农科院烟草研究所植保室提供。将菌种接种于马铃薯琼脂培养基上，放置在28℃的培养箱中培养大约两周。接种前用无菌水浸泡，刮下菌丝体，用无菌蒸馏水配制成孢子浓度约为1×106个/mL的悬浮液，作为接种菌液备用。

3.3 SSR引物
本研究选用的130对SSR引物，均在M号连锁群上，来自Bindler等(2011)公开发表的SSR引物序列，委托上海生工公司合成。

3.4 DNA提取
采用稍加改良的CTAB法提取供试植株叶片DNA，用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测其质量后，用双蒸水稀释到约30~50 ng/μL，在冰箱-20℃中冷冻保存备用。

3.5 PCR反应与凝胶电泳检测
PCR反应总体积15 μL，其中DNA模板1.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL、dNTP (2 mmol/L) 2 μL、10×Taq Buffer 2 μL、MgCl₂ (25 mmol/μL) 1.2 μL、Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL、ddH₂O 5.1 μL。

PCR反应在96孔ABI梯度基因扩增仪上按以下程序运行：首先94℃预变性5 min；94℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸5 min，最后4℃保存。其中，退火温度根据引物序列差异略加调整。

PCR反应结束后，取4.5 μL反应液在8%非变性的聚丙烯酰胺凝胶上，采用恒电压950 V电泳1.5 h左右。电泳结束后，凝胶用NaOH银染法(任民等, 2008)染色显影。

3.6数据整理统计分析
数据利用软件Windows QTL Cartographer中的CIM模块进行整理统计分析。

作者贡献
蒋彩虹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；任民、张兴伟和程立锐协助完成数据分析，论文初稿的写作；杨爱国指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；王元英、罗成刚和冯全福是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家烟草专卖局项目(110201002002)和中国烟草总公司四川省公司科技项目(201101004)共同资助。

参考文献
Bindler G., Plieske J., Bakaher N., Gunduz I., Ivanov N., van der Hoeven R., Ganal M., and Donini P., 2011, A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L.) obtained from large scale microsatellite marker development, Theor. Appl. Genet., 123(2): 219-230

Bindler G., van der Hoeven R., Gunduz I., Plieske J., Ganal M., Rossi L., Gadani F., and Donini P., 2007, A microsatellite marker based linkage map of tobacco, Theor. Appl. Genet., 114(2): 341-349

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